Abstract: Javanese chili (Piper retrofractum Vahl) is a traditional medicinal plant originating from Indonesia and has many pharmacological activities, one of which is often used as a base for aphrodisiac herbal medicine. The population of P. retrofractum is limited, so it is necessary to design secondary metabolite production and propagation efforts using plant tissue culture techniques. The materials used in this study were explants of P. retrofractum leaves that were induced in Murashige and Skoog (MS) media and the ratio of growth regulators 2.4-dichlorophenoxyacetis acid (2,4-D): Benzyl Amino Purine (BAP) 0.5: 0.5. The results showed that the callus of P. retrofractum was formed in the growth regulator 2.4D: BAP (0.5: 0.5). TLC and spectrophotometry identified the secondary metabolite content of callus. Secondary metabolite analysis using the thin layer chromatography (TLC) method using the mobile phase ethyl acetate: n-hexane (7: 3) showed a terpenoid compound indicated by purple spots on the visual appearance after spraying 10% spotting vanillin. Identification using infrared spectrophotometry shows functional groups -CH, C = O, C = C, -CH2, and -CH3, characteristic of terpenoid compounds. Based on TLC data and spectrophotometry, callus P. retrofractum is thought to contain terpenoid compounds. This study's results are expected to be the basis for developing secondary metabolite production in P. retrofractum with cell suspension culture and P. retrofractum propagation by micropropagation. Abstrak: Cabai Jawa (Piper retrofractum  Vahl) merupakan tanaman obat tradisional yang berasal dari Indonesia dan banyak memiliki aktivitas farmakologis salah satunya sering digunakan sebagai bahan dasar jamu afrodisiaka. Populasi tanaman cabai Jawa terbatas maka perlu dirancang upaya produksi metabolit sekunder dan upaya perbanyakan tanaman cabai Jawa salah satunya menggunakan teknik kultur jaringan tanaman. Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah eksplan daun tanaman cabai Jawa yang diinduksi pada media Murashige and Skoog (MS) dan perbandingan zat pengatur tumbuh 2.4-dichlorophenoxyacetis acid (2,4-D) : Benzyl Amino Purine (BAP) 0,5 : 0,5. Hasil penelitian menunjukkan bahwa kalus cabai Jawa terbentuk dalam zat pengatur tumbuh 2,4D: BAP (0,5: 0,5). Kandungan metabolit sekunder dari kalus diidentifikasi dengan KLT dan spektrofotometri. Analisis metabolit sekunder menggunakan metode kromatografi lapis tipis (KLT) menggunakan fasa gerak etil asetat: n-heksana (7: 3) menunjukkan adanya senyawa terpenoid yang ditunjukkan dengan adanya bercak ungu pada penampakan visual setelah disemprotkan spotting vanilin 10%. Hasil Identifikasi menggunakan spektrofotometri UV-Vis  menunjukkan isolat mempunyai panjang gelombang maksimum 272,6 nm. Identifikasi menggunakan spektrofotometri inframerah menunjukkan adanya gugus fungsi -CH, C = O, C = C, -CH2, dan -CH3 yang merupakan ciri khas senyawa terpenoid . Berdasarkan data KLT dan spektrofotometri kalus cabai Jawa diduga mengandung senyawa terpenoid. Hasil penelitian ini diharapkan dapat menjadi dasar pemgembangan produksi metabolit sekunder dalam tanaman cabai Jawa dengan kultur suspensi sel dan perbanyakan tanaman cabai Jawa dengan mikropropagasi.