Penelitian ini mengembangkan Four-tier multiple choice diagnostic test (tes diagnostik pilihan ganda empat tingkat) pada materi katabolisme. Penelitian ini bertujuan untuk mendeskripsikan karakteristik butir soal instumen tes diagnostik empat tingkat, dan mendeteksi pemahaman konsep kognitif yang dialami peserta didik pada materi katabolisme. Jenis penelitian ini adalah Research and Development (R&D). Subjek uji coba adalah peserta didik kelas XII IPA MAN 2 Semarang tahun ajaran 2018/2019. Metode pengambilan data yang digunakan adalah wawancara, tes, pengisian angket, dan dokumentasi. Tes diagnostik terdiri dari empat tingkat, yaitu tingkat pertama terdiri dari pertanyaan dengan satu kunci jawaban dan empat pengecoh, tingkat kedua terdiri dari tingkat keyakinan jawaban, tingkat ketiga terdiri dari pilihan alasan, dan tingkat keempat terdiri dari tingkat keyakinan alasan. Instrumen yang dihasilkan berupa kisi-kisi, petunjuk pengerjaan soal, soal tes, kunci jawaban, petunjuk pengisian lembar jawaban, lembar jawaban, pedoman penskoran, dan pedoman interpretasi hasil. Instrumen soal ini layak digunakan berdasarkan uji validasi oleh empat dosen yakni dua dosen ahli materi dan dua dosen ahli evaluasi. Instrumen yang dikembangkan sebanyak 40 butir soal. Hasil validasi menunjukkan 37 butir soal valid, dan 3 butir soal tidak valid dan semua reliabel. Reliabilitas butir soal yang dikembangkan masuk kategori tinggi yaitu sebesar 0,894. Produk akhir butir soal yang dihasilkan mempunyai jumlah 37 butir soal terdiri dari 4 butir soal mudah, 24 butir soal sedang, dan 9 butir soal susah. Butir soal yang dikembangkan juga memiliki daya beda dengan kategori  4 butir soal cukup baik dan 33 butir soal baik. sebanyak 18 indikator soal ditemukan mengalami miskonsepsi. Miskonsepsi tertinggi ditemukan pada konsep analisis peran enzim. Miskonsepsi terendah ditemukan pada konsep analisis peran ATP dan perubahan molekul saat transpor elektron dan fosforilasi oksidatif