Latar Belakang: Tuberkulosis (TB) adalah penyakit menular yang disebabkan oleh Mycobacterium tuberculosis. Indonesia di peringkat ketiga di dunia menyumbang 8% untuk kasus TB. Fenomena yang terjadi di wilayah kerja Puskesmas Tlogosadang yaitu adanya peningkatan kasus TB BTA positif. Hal ini diduga disebabkan oleh faktor kondisi fisik rumah pasien TB paru khususnya luas ventilasi dan pencahayaan alaminya yang tidak terstandar. Tujuan: Menganalisis hubungan luas ventilasi dan pencahayaan alami rumah terhadap tingkat kepositifan sputum BTA pada penderita TB paru di Puskesmas Tlogosadang. Metode: Penelitian ini menggunakan desain kohort retrospektif. Responden penelitian diambil dengan metode simple random sampling pada 38 penderita TB paru BTA positif pada tahun 2016 - 2018. Pengamatan luas ventilasi (minimal 10% dari luas lantai), sedangkan pencahayaan alami (minimal 60 lux). Pengamatan rekam medis tingkat kepositifan BTA (Scanty, +1, +2, dan +3) dilakukan di Laboratorium Puskesmas Tlogosadang, kemudian dicatat dalam check list observasi. Hasil: Didapatkan 3 responden dengan BTA scanty, 20 responden (+1), 14 responden (+2), dan 1 responden (+3). Lebih dari 65 % luas ventilasi dan pencahayaan alami rumah tidak terstandar. Hasil analisis uji koefisien kontingensi menunjukkan hubungan luas ventilasi (p = 0,60) dan pencahayaan alami (p = 0,24) terhadap tingkat kepositifan sputum BTA. Kesimpulan: Tidak terdapat hubungan luas ventilasi dan pencahayaan alami rumah terhadap tingkat kepositifan sputum BTA pada penderita TB paru di Puskesmas Tlogosadang.