Asiklovir merupakan derivat guanosin yang berkhasiat untuk pengobatan infeksi virus herpes. Namun penelitian tentang validasi metode penetapan kadar acyclovir masih jarang dilakukan, maka perlu adanya pengembangan. Tujuan penelitian ini adalah melakukan validasi metode penetapan kadar asiklovir menggunakan KCKT dan aplikasinya dalam sediaan salep. Validasi penetapan kadar salep asiklovir menggunakan KCKT dengan kolom C18 dan fase gerak hasil optimasi campuran asetonitril:asam fosfat (80:20 v/v) dan detektor uv-visibel 254 nm. Uji validasi yang dilakukan meliputi akurasi, presisi, selektivitas, linieritas dan sensitivitas. Metode  tervalidasi diaplikasikan pada penetapan kadar salep asiklovir. Hasil penelitian menunjukkan bahwa uji validasi memenuhi persyaratan sebagai berikut : Uji akurasi dengan perolehan kembali 99,603-101,800 %, uji presisi dengan nilai RSD 0,302 %, selektivitas yang baik, linieritas dengan nilai korelasi (r) 0,9998, LOD sebesar 0,282 µg/mL dan LOQ sebesar 0,635 µg/mL. Hasil penetapan kadar menggunakan metode KCKT pada sediaan salep diperoleh hasil 104,632%. Hal ini memenuhi persyaratan kadar yang ditetapkan Farmakope Indonesia Edisi V (2014). Kata kunci: asiklovir, salep, validasi