ABSTRAKIndonesia adalah salah satu negara yang kaya akan jenis flora yang berkhasiat sebagai tanaman obat. Salah satunya yaitu kembang bulan (Tithonia diversifolia). Dari uji yang pernah dilakukan, tanaman ini mengandung senyawa flavonoid yang berguna sebagai anti bakteri dan anti diabetes. Dalam penelitian ini akan ditentukan jenis eluen terbaik untuk mengisolasi senyawa flavonoid dan jenis senyawa flavonoid yang terdapat dalam ekstrak daun kembang bulan. Ekstraksi senyawa flavonoid dari daun kembang bulan dilakukan dengan cara maserasi menggunakan pelarut aseton : air (7:3) selama 5x24 jam, kemudian dilakukan fraksinasi menggunakan pelarut n-heksana dan etil asetat. Setelah itu, dilakukan uji fitokimia senyawa flavonoid menggunakan uji Wilstatter, Bate-Smith dan NaOH 10%. Pemisahan senyawa flavonoid dari ekstrak dilakukan dengan kromatografi lapis tipis (KLT) untuk mencari eluen terbaik dengan variasi eluen yaitu n-heksana : etil asetat (8:2), asam asetat : H2O : HCl pekat (30:10:3), n-butanol : asam asetat : air (4:1:5), dan metanol : etil asetat (4:1), kemudian dilanjutkan dengan isolasi senyawa flavonoid. Identifikasi senyawa flavonoid dilakukan dengan metode pereaksi geser dan FTIR. Hasil penelitian menunjukkan bahwa dari uji fitokimia dari ketiga reagen menunjukkan positif mengandung senyawa flavonoid. Eluen terbaik dalam pemisahan senyawa flavonoid dengan KLT adalah n-heksana : etil asetat (8:2) yang dapat digunakan dalam mengisolasi senyawa flavonoid. Eluen ini memisahkan 3 noda dengan warna jingga. Berdasarkan hasil analisis spektrofotometer UV-Vis (metode pereaksi geser), menunjukkan bahwa isolat adalah golongan flavonol. Hasil identifikasi dengan FTIR menunjukkan serapan-serapan yang spesifik dari senyawa flavonoid seperti rentangan asimetri OH pada bilangan gelombang 3443,9 cm-1, rentangan cincin aromatik pada 11367,9 cm-1, pita serapan kuat karbonil pada angka 1648,3 cm-1 dan golongan eter yang diperkuat oleh puncak serapan 1060,3 cm-1 sehingga senyawa flavonoid yang diduga adalah 5,7,8,3’,4’-pentahidroksiflavonol atau 5,6,7,3’,4’-pentahidroksiflavonol.