Tetes tebu merupakan limbah pengolahan gula yang mengandung gula cukup tinggi sehingga sangat potensial dimanfaatkan sebagai media fermentasi. Fermentasi tetes tebu untuk menghasilkan bioetanol menjadi salah satu upaya megurangi jumlah limbah dan memenuhi kebutuhan Bahan Bakar Minyak (BBM) yang semakin meningkat. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui pengaruh pH dan lama fermentasi terhadap produksi bioetanol dari tetes tebu (molase) dengan cara fermentasi menggunakan Saccharomyces cerevisiae. Penelitian ini meliputi proses fermentasi dan pemisahan bioetanol dari media fermentasi. Proses fermentasi dilakukan dengan variasi pH 4, 4,5, dan 5, sedangkan variasi lama fermentasi dilakukan selama 3, 4, 5, dan 6 hari. Bioetanol hasil fermentasi dipisahkan dari media fermentasi dengan metode destilasi fraksinasi dan untuk mengukur kadar bioetanol digunakan metode kromatografi gas. Data yang diperoleh pada setiap perlakuan dianalisis menggunakan analisis varians (ANOVA) dan dilanjutkan dengan uji Beda Nyata Terkecil (BNT) 5 %. Kadar bioetanol tertinggi diperoleh sebesar 7,76 %, nilai yield tertinggi 89,89 %, dan nilai efisiensi 78,62 %. Hasil analisis menggunakan uji ANOVA (α=5 %) menunjukkan bahwa pH dan lama fermentasi berpengaruh nyata terhadap kadar bioetanol hasil fermentasi. Uji BNT menyatakan bahwa perlakuan A3T4 (pH 5 dan lama fermentasi 6 hari) dengan kadar bioetanol 7,76 % , nilai efisiensi 78,62 %, dan kadar gula sisa 5,52 %  merupakan perlakuan yang berbeda nyata.